CONSUMO RESPONSABLE DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS: Evaluación in vitro del efecto antioxidante de un cóctel a base de pesgua (Syzygium cumini)

Materiales y Métodos

Tipo de investigación

Descriptivo experimental, debido a que la investigación tiene como objetivo describir algunas características fundamentales de la bebida funcional, utilizando criterios sistemáticos que permiten establecer la estructura o el comportamiento de los fenómenos en estudio, proporcionando información sistemática y comparable con la de otras fuentes.

Materiales y Métodos.

Material vegetal:

Para el estudio se seleccionará, extracto del fruto de pesgua (Syzygium cumini). La recolección se realizó a partir de la cosecha de los árboles de pesgua extranjera, las cuales se encontraron en fincas ubicadas en calabozo, estado Guárico, de tal manera que cada 2 semanas en temporada de verano se fue realizando la recolección de la misma, las cuales se conservarán congelando el fruto, hasta el momento de ser utilizadas para realizar el trabajo.

Muestra biológica:

Suspensión de eritrocitos.

Obtención del extracto alcohólico

Una vez recolectado el fruto, se procedió a lavar el mismo, con agua destilada, evitando agitación. Posterior a esto, se procederá a pesar 50g de material vegetal (fruto entero) y se colocarán a maceración con 250ml de vodka al 40% por 48 horas. Luego de este periodo de tiempo se procedió a separar, el material vegetal del extracto alcohólico y será filtrado con papel de whatman nº 4. El extracto obtenido se colocó en una manta de calentamiento, a una temperatura de 100̊ por 20 minutos, esta se enfriará y se almacenará hasta su análisis y diseño del cóctel. (Martínez et al., 2010).

Preparación de la suspensión de eritrocitos

Para llevar a cabo la separación de células sanguíneas humanas, se extrajo 5 mL de sangre venosa, la cual serán colocadas en un tubo con etilendiamino tetra acético anticoagulante (EDTA), se utilizó 4 mL de cada muestra para los eritrocitos. El proceso para la separación de los eritrocitos comenzó con la centrifugación de 4 mL de sangre para 5 min a 1500 r.p.m (rotor Beckman® JA-20, a temperatura ambiente; se recogió con sumo cuidado, para evitar riesgo de hemólisis. Se descartó el suero y luego se tomó 1 mL del paquete celular, se dividió en dos alícuotas de 500 μL (A y B) que se lavaron con 600 mL de solución salina tamponada con fosfato para descartar el resto del suero. Se re suspendió en PBS glucosado para luego ser centrifugados a 1500 r.p.m, por 12 min (Goyal et al., 2012).

Determinación del perfil fitoquímico del extracto acuoso de Hibiscus sabdariffa, por cromatográfia liquida de alta eficiencia (HPLC).

Se empleó un cromatógrafo de líquidos Hewlett Packard HP1100 equipado con bomba cuaternaria, equipo de termostatizacion de columnas, muestreador automático y detector. La separación cromatográfica se desarrolló con una columna RP18 Pecosphere (Perkin Elmer – BrownLee Columns) de 83mm x 4,6mm. La detección se Ilevó a cabo a 280 nm y a una temperatura de 25°C para el muestreador y el equipo de termostatización de la columna. La velocidad de flujo fue de 0,45 mL/min. Finalmente se inyectaron 20 mL del extracto y se emplearon los patrones correspondientes para la cuantificación e identificación (Borrás-Linares et al., 2015).

Evaluación de capacidad antioxidante del extracto

Evaluación por método químico

Para evaluar la actividad antioxidante se usó el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co®) con una solución 100 µM de DPPH en metanol al 80 %, la cual permitió observar una disminución de la absorbancia, debido a la cesión de un átomo de hidrógeno por parte de los compuestos antioxidantes presentes en los extractos. En una cubeta de vidrio se colocó 100 µL de extracto y 2,9 mL de DPPH. La absorbancia se monitoreo cada 5 min por 30 min a una longitud de onda de 515 nm. La absorbancia de referencia (A₀) se obtuvo al sustituir el volumen de extracto por metanol al 80 %. El porcentaje de reducción de DPPH se obtuvo de la expresión: DPPH (%)= (A₀ – An) 100 / A₀, donde A₀ y An fueron las absorbancias de referencia y de la muestra, respectivamente. Se empleó una solución del ácido 6-hidroxi-2,5, 7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico (TROLOX ≤100% de la actividad antioxidante) (Pacheco-Coello et al., 2020).

Evaluación por método biológico con peróxido de hidrogeno

Para la evaluación de la actividad anti hemolítica del extracto acuoso se procedió a diluir los extractos 1/2, 1/4 y 1/8. Del extracto puro y de las diluciones realizadas se tomó 1mL de extracto y se combinó con 1 mL de peróxido de hidrogeno al 3 % (H₂O₂), incubándose por 5 min a 37 ºC. Posteriormente, se tomó un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubo con 800 μL de la combinación del extracto con el H₂O_{2 ,}durante 5 min a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugo a 8.000 r.p.m por 12 min y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (Thermo Scintific). Se empleó un control de hemolisis (≈100%) y no hemolisis (≈0%), usando H O2 al 3% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Evaluación por método biológico con carbonato de sodio

Para la evaluación de la actividad anti hemolítica del extracto acuoso se procedió a diluir los extractos 1/2, 1/4 y 1/8. Del extracto puro y de las diluciones realizadas se tomó 1mL de extracto y se combinó con 1 mL de carbonato de sodio (Na₂CO₃), incubándose por 5 min a 37 ºC. Posteriormente, se tomó un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubo con 800 μL de la combinación del extracto con el Na₂CO₃ durante 5 min a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugo a 8.000 r.p.m por 12 min y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (Thermo Scintific). Se empleó un control de hemolisis (≈100%) y no hemolisis (≈0%), usando Na₂CO₃ y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Ensayo de oxidación de LDL

Los tubos se agitaron con un vórtex y llevados a una temperatura de 2 °C durante 15 min, para luego ser nuevamente agitados y centrifugados a 5000 rpm a 4 °C durante 5 min. El sobrenadante que corresponde al plasma se transfirió volumétricamente a un tubo falcon estéril de 15 mL y se adicionó el reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico 500 mM y cloruro de magnesio 500 mM) en relación 2:1 v/v con el plasma obtenido. El reactivo precipitante y el plasma se agitaron durante 2 min en vórtex y, posteriormente, se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 10 min. El sobrenadante obtenido (LDL) este se con buffer de fosfatos 10 mM y 0,16 M de NaCl, pH 7,4 hasta 100 mL. Seguidamente se llevó a cabo la oxidación de las LDL que consistió en tomar 115 μL de solución de LDL, 100 μL de extracto acuoso con buffer de fosfatos, 235 μL de buffer de fosfatos salino y 50 μL de CuSO4 100 μM, el cual actúa como oxidante de las LDL. La mezcla se agitó en vórtex durante 2 min y luego se incubó a 37 °C en agitación durante 8 h. Para detener la oxidación las muestras fueron transferidas por una columna de Sephadex G-50, tomando 550 μL del eluido y 500 μL de ácido tricloroacético (ATA) 25 % p/v. Posteriormente, se adicionaron 500 μL de ácido tiobarbitúrico 1 % p/v. Se agitó nuevamente en vórtex durante 1 min y se incubó a 95 °C por 1 h en oscuridad. Luego, se dejó enfriar durante 1 h, en oscuridad a temperatura ambiente (25 °C) y se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min. Se realizó una curva de calibración del método de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y se utilizó como estándar 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP) en concentraciones de 0,5 a 10 μM. Se midieron las absorbancias de las muestra, patrones, control (paciente sin hiperlipidemia) y los resultados se expresaron como μg TMP/100 g de MV (Ruiz et al., 2006; Da‐Costa‐Rocha et al., 2014)

Preparación del cóctel

Para la elaboración del cóctel tipo Martini se utilizó los siguientes ingredientes:

• 2 1/2 oz de extracto alcohólico de Syzygium cumini. (Pesgua)

• 1 oz de vodka

• ½ onza de jarabe simple

Para la preparación del cóctel se colocó hielo en la copa Martini para enfriarla. Posteriormente en una coctelera americana se agito el extracto alcohólico, se rompió el hielo de la copa y se transfirió el extracto. Por último, se adiciono el vodka y el jarabe simple directamente a la copa, usando luego como guarnición (decoración) una rodaja de limón o naranja y una garnitura compuesta de uva de pesgua.

Análisis de datos

La determinación de compuestos fenólicos totales y flavonoides se realizó por triplicado, expresándose como medias ± desviación estándar. Referente a la actividad antioxidante, hemolítica y anti hemolítica se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows.

RESULTADOS

Perfil fitoquímico y gramaje alcohólico del extracto a base de pesgua Syzygium cumini.

El análisis del perfil fitoquímico del extracto por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) arrojó que el extracto estuvo constituido por cuatro grupos de biomoléculas como ácidos fenólicos, flavonoides, y antocianinas, siendo estas últimas las de mayor concentración (Tabla 1).