ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, HEMOLÍTICA Y ANTIHEMOLÍTICA DE EXTRACTOS ACUOSOS DE LAS ESPECIES Hibiscus arnotiannus, H. cannabinus, H. mutabilis, H. rosa-sinensis e H. sabdariffa

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de investigación

La presente investigación fue llevada a cabo bajo la modalidad descriptiva-experimental. En primer lugar, se determinó la concentración de compuestos fenólicos totales (CFT), flavonoides totales (FT) y antocianinas que posee el material vegetal de las cinco especies en estudio, H. sabdariffa, H. rosasinensis, H. arnottianus, H. cannabinus e H. mutabilis. Partiendo de la concentración de CFT obtenida, se procedió a preparar cinco concentraciones (diluciones seriadas) de los extractos acuosos de las cinco especies del género Hibiscus antes señaladas (variable independiente) para proceder a determinar su efecto sobre una suspensión de glóbulos rojos (variable dependiente), a fin de evaluar la actividad antioxidante por métodos químicos y biológicos, y por otro lado determinar la actividad hemolítica y antihemolítica que ejercen los extractos sobre la suspensión.

Material vegetal

El material vegetal estuvo constituido por los pétalos de cuatro especies del género Hibiscus y los cálices de H. sabdariffa. La recolección se realizó a partir de los arbustos de las especies H. sabdariffa, H. rosa-sinensis, H. arnottianus, H. cannabinusy H. mutabilis, y también de cálices deshidratados de H. sabdariffa, los cuales fueron secados y almacenados a temperatura ambiente, con escasa aireación y bajo sombra, para evitar la acción del oxígeno, la luz, la temperatura y microorganismos; factores que podrían transformar los compuestos originales en artefactos (Hostettmann, 2008). Posteriormente, fueron procesados en el Laboratorio de Metales Pesados de la Universidad de Carabobo Sede Aragua.

Procedimiento experimental

Preparación de extractos acuosos

Una vez obtenidos los pétalos totalmente deshidratados de las especies de Hibiscus en estudio, se procedió a triturarlos manualmente usando una bola molino, hasta obtener un tamaño de partícula menor a 1 mm. Posteriormente, se pesaron 2,5 g del material vegetal, se colocaron en un vaso de precipitado con 250 mL de agua destilada y se llevaron a una plancha de calentamiento a 150 °C hasta su ebullición. Luego, se dejó enfriar a temperatura ambiente, y se procedió a filtrar utilizando papel de filtro Whatman número 4 (Pacheco et al., 2020).

Preparación de suspensión de eritrocitos

Para llevar a cabo la separación de células sanguíneas humanas, se procedió a la extracción de 5 mL de sangre de la vena del antebrazo de un donante. La muestra fue colocada en un tubo con el anticoagulante etilendiaminotetraacético (EDTA). El proceso para la separación de los eritrocitos comenzó con la centrifugación de la sangre por 5 minutos a 1500 rpm (rotor Beckman^® JA-20), a temperatura ambiente; se manípulo con sumo cuidado, para evitar riesgo de hemólisis. Se descartó el plasma y luego se tomó 1 mL del paquete celular, se dividió en dos alícuotas de 500 μL (A y B) que se lavaron con 600 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para descartar el resto del plasma. Se resuspendieron en PBS glucosilado para luego ser centrifugados a 1500 rpm por 12 minutos (Goyalet al., 2012). La suspensión final de eritrocitos se utilizó para los ensayos de evaluación de actividad hemolítica y antihemolítica.

Determinación de compuestos fenólicos totales (Método colorimétrico de Folin-Ciocalteu)

La determinación de compuestos fenólicos totales se realizó mediante el Método colorimétrico de Folin-Ciocalteu en el material vegetal de las especies de Hibiscus en estudio. Para ello, se procedió a mezclar 50 µL de cada uno de los extractos acuosos con 125 µL del reactivo de Folin y 400 µL de carbonato de sodio al 7,1% (m/v), completándose con agua destilada hasta 1 mL. Este procedimiento se realizó por quintuplicado. Por consiguiente, se prepararon cinco patrones a concentraciones de 50, 100,150, 200 y 250 µg/mL, a partir de una solución patrón madre de ácido gálico con 500 µg/mL. La lectura se realizó en un espectrofotómetro a 760 nm, expresándose los resultados como mg de ácido gálico equivalente en 100g de material vegetal (Peluso y Serafini, 2017).

Determinación de los flavonoides (Método colorimétrico)

Para la determinación de flavonoides mediante el método colorimétrico, se procedió según lo establecido por Marinovaet et al. (2005). En primer lugar, se mezclaron 100 µL del extracto acuoso con 30 µL de NaNO₂ al 5% (m/v), 30 µL de AlCl₃ 10% (m/v), 200 µL de NaOH 1 M; ajustando con agua destilada hasta un volumen final de 1 mL. Posteriormente, se realizó la lectura a 510 nm y se comparó con la curva patrón usando como estándar catequina. Los resultados se expresaron como equivalente de catequina en mg/g de material vegetal.

Determinación de las Antocianinas

La determinación de Antocianinas se emplea con 1 ml de cada extracto y se añadió a 5 ml agua destilada a una temperatura de 50 0C. Posteriormente una vez alcanzada la temperatura ambiente se le añadió 1 ml de solución de cloruro férrico al 0,1%. De acuerdo al aspecto de color verde pardusco o coloración azul negro confirma la presencia de antocianinas valor que se expresa en forma de cruses (EL-Farmawi D et al., 2013).

Determinación de la actividad antioxidante por el método DPPH

Para la actividad antioxidante se empleó el método del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Aldrich Co^®) con una solución 100 µM de DPPH en metanol al 80%, la cual permite observar una disminución de la absorbancia, debido a la cesión de un átomo de hidrógeno por parte de los compuestos antioxidantes presentes en los extractos. En una cubeta de vidrio se colocó 100 µL de extracto acuoso y 2,9 mL de DPPH. La absorbancia fue monitoreada cada 5 min por 30 min a una longitud de onda de 515 nm. La absorbancia de referencia (A₀) se obtuvo al sustituir el volumen de extracto por metanol al 80%. El porcentaje de reducción de DPPH se obtuvo de la expresión: DPPH (%) = (A₀ – An) 100 / A₀, donde A₀ y An serán las absorbancias de referencia y de la muestra, respectivamente. Se empleó una solución patrón ácido ascórbico (vitamina C) (Pacheco-Coello et al., 2020).

Evaluación de la actividad hemolítica

Para la evaluación de la actividad hemolítica de los extractos acuosos, se utilizó con el extracto puro y con concentraciones de 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg de ácido gálico (fenol)/ml. Se tomó un volumen de 500 μL de suspensión de glóbulos rojos y se incubó con 500 μL de la combinación del extracto puro y de cada concentración por 5 min a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugó 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈ 100%) y no hemólisis (≈ 0%), usando H₂O₂ al 3% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Evaluación de actividad antihemolítica en presencia de peróxido de hidrógeno (H₂O₂)

Para la evaluación de la actividad antihemolítica de los extractos acuosos, se utilizó con el extracto puro y con concentraciones de 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg de ácido gálico (fenol)/mL. Del extracto puro y de cada una de las diferentes concentraciones, se tomó 1mL y se combinó con 1mL de H₂O₂ al 3%, incubándose durante 5 minutos a 37 ºC. Posteriormente, un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubó con 800 μL de la combinación del extracto y el H₂O₂, durante 5 minutos a 37 ºC; después de este tratamiento, se centrifugó a 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈ 100%) y no hemólisis (≈ 0%), usando H₂O₂ al 3% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Evaluación de actividad antihemolítica en presencia de carbonato de calcio (CaCO₃)

Se procedió según lo descrito en el punto anterior, pero combinando el extracto puro con las diluciones de 1 mL de CaCO₃ al 5%, incubándose por 5 minutos a 37 ºC. Se tomó, un volumen de 200 μL de suspensión de glóbulos rojos se incubó con 800 μL de la combinación del extracto y el CaCO₃, durante 5 minutos a 37 ºC; después de este procedimiento, se centrifugó a 8.000 rpm durante 12 minutos y el sobrenadante fue usado para medir la hemoglobina libre a una longitud de onda 540 nm, empleando el equipo de absorción molecular Génesis 20 (ThermoScientific). Se empleó un control de hemólisis (≈ 100%) y no hemolisis (≈ 0%), usando CaCO₃ al 5% y solución salina al 95% (NaCl) (Pacheco-Coello et al., 2021).

Análisis de datos

Las determinaciones de compuestos fenólicos totales y flavonoides se realizaron por triplicado, expresándose como medias ± desviación estándar. Referente a la actividad antihemolítica, se aplicó un análisis de varianza de dos vías con interacción (ANOVA), usando el programa Statistix 9.0 para Windows. El intervalo de confianza fue del 95% siendo estadísticamente significativo si p ≤ 0,05.